期刊简介
本刊（中国自然科学核心期刊）系军事医学科学院主办的国内外公开发行的综合性学术期刊。本刊以刊登军事医学及相关学科的创新性论著为主，选登部分研究简报，技术方法及有一定指导性的文献综述。内容涉及放射医学、微生物学与流行病学、药理学与毒理学、药物化学、基础医学、卫生学与环境医学、卫生装备、临床医学及医学高新技术等领域。
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- 杂志名称：军事医学杂志
- 主管单位：军事医学科学院
- 主办单位：军事医学科学院
- 国际刊号：1674-9960
- 国内刊号：11-5950/R
- 出版周期：月刊
期刊荣誉：中国自然科学核心期刊期刊收录：知网收录(中), 上海图书馆馆藏, CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版), CA 化学文摘(美), 北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊), JST 日本科学技术振兴机构数据库(日), 维普收录(中), 国家图书馆馆藏, 万方收录(中), 统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊)
毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析
樊宇；唱韶红；巩新；刘波；吴军
关键词：α凝血酶, ecarin, 凝血酶原-2, 毕赤酵母, HEK 293T细胞
摘要：目的：通过毕赤酵母（Pichia pastoris）表达制备重组人凝血酶原2（prothrombin-2），并利用锯鳞蝰（Echis carinatus）凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶，分析凝血酶的活性。方法根据GenBank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列，设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体pPICZαA中，转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌，诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2，培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备，并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3．1（＋），瞬转HEK 293T细胞，收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应，利用凝血酶发色底物S-2238，测反应产物的酶促活性；利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白，去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103，与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定，纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后，可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺（pNA），且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高；经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结，与凝血酶试剂的血凝时间接近，且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2，被ecarin活化为具有活性的凝血酶，有望替代从血浆中提取的凝血酶原，用于战伤救治和临床研究。
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